Kanał potasowy KIR4.1 jako cel immunologiczny w stwardnieniu rozsianym AD 3

Plamki zebrano i poddano analizie metodą desorpcji laserowej z tandemową spektrometrią masową (Alphalyse) wspomaganej matrycą w celu identyfikacji. Jako kontrolę oczyszczono równoległe próbki połączonych przeciwciał IgG w surowicy od 12 osób z innymi chorobami neurologicznymi. Aby określić, czy oczyszczone przeciwciała wiążą się z KIR4.1, zastosowaliśmy oczyszczone przeciwciała IgG do immunoprecypitacji lizatu nerki szczura, 19 ludzkiego lizatu mózgu i próbki białka KIR4.1 poddanego translacji in vitro. Eluowano białko, a następnie poddawano je analizie Western blot stosując królicze przeciwciało przeciw KIR4.1 (patrz Dodatek dodatkowy). Testy immunoenzymatyczne związane z enzymem
Użyto oczyszczonego rekombinowanego KIR4.1 związanego z płytką (patrz Dodatek dodatkowy) w celu zbadania reaktywności anty-KIR4.1 w próbkach surowicy. Zastosowaliśmy dwie kontrole negatywne: płytki pokryte ściekami ( flow-through ) otrzymane po oczyszczeniu KIR4.1 z użyciem kulek agarozowych HisPur z agarozą (Thermo Scientific) i płytek pokrytych albuminą z surowicy bydlęcej. Oczyszczone białko rozcieńczono w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do końcowego stężenia 6 ?g na mililitr, a 100 ?l dodano do każdego dołka płytek aminowych Nunc Immobilizer (Thermo Scientific). Płytki pozostawiono na noc w 4 ° C na obrotowej wytrząsarce. Powlekane płytki przemyto dwukrotnie PBS z detergentem Tween 20 i zablokowano przez godzinę 10 mM etanoloaminą w 100 mM wodorowęglanie sodu, pH 9,6. Wszystkie testy przeprowadzono na ślepych próbkach, przeprowadzono w dwóch powtórzeniach i kontrolowano za pomocą standardowych próbek surowicy w dwóch rozcieńczeniach. Aktywność anty-KIR4.1 w surowicy pacjentów i kontrole z serii wykrywania i dwie serie walidacji określono za pomocą tego testu.
Dooponowe wstrzyknięcie IgG u myszy
W celu wykazania patogenności surowiczego przeciwciała swoistego wobec IgG KIR4.1 in vivo, oczyszczono surowice IgG od osób ze stwardnieniem rozsianym, które miały wysokie miana przeciwciał przeciwko KIR4.1. Rozszczepiliśmy oczyszczoną IgG na dwie frakcje i zubożono przeciwciała specyficzne dla KIR4.1 z jednej z tych frakcji, stosując kolumnę z przedabsorpcją zawierającą rekombinowane białko KIR4.1 związane z kulkami. Frakcje IgG wstrzyknięto myszom w sposób dookólny, jak opisano wcześniej. Dalsze szczegóły i walidację przygotowanych frakcji IgG podano w Dodatku uzupełniającym.
Analiza statystyczna
Uważaliśmy, że próbki surowicy są pozytywne pod względem przeciwciał, gdy gęstość optyczna przekroczyła wartość odcięcia, która została ustalona na 5 SD powyżej średniej gęstości optycznej w próbkach surowicy od zdrowych dawców. W doświadczeniach przesiewowych porównano reaktywność surowicy anty-KIR4.1 z zastosowaniem testu Kruskala-Wallisa do jednostronnej analizy wariancji, a następnie testu wielokrotnego porównania Dunna lub testu t Manna-Whitneya, dla którego P wartości są pokazane
[hasła pokrewne: logopeda wrocław, autyzm terapia, leczenie uzależnień ]

Powiązane tematy z artykułem: autyzm terapia leczenie uzależnień logopeda wrocław